Quantification de faibles concentrations d'ADN plasmidique et d'ADN simple brin par dosage fluorimétrique
Afin de déterminer si le reconditionnement des tubes de microcentrifugeuse affecte la précision de la quantification des acides nucléiques (dans la gamme des ng et des μg), nous avons réalisé des dosages fluorimétriques sur deux types d’ADN : l’ADN double brin (dsADN), correspondant au plasmide pCL7c (~5 kb), à l’aide du kit AccuBlue NextGen (Biotium), et de l’ADN simple brin (ssADN) à l’aide du kit Helixyte Green (AAT Bioquest). Les analyses ont été réalisées dans des tubes de microcentrifugeuse en polypropylène de 1,5 ml pour l’ADN double brin et dans des tubes de 0,6 ml pour l’ADN simple brin.
Les tubes de microcentrifugeuse ont été soumis à un cycle de reconditionnement, puis réutilisés pour réaliser les dosages, en comparaison avec des consommables neufs : deux marques dans le cas du simple brin (M1 Invitrogen Low-binding, M2 Corning) et trois marques dans le cas du double brin (M1 Invitrogen Low-binding, M2 Corning, M3 FunChem). Les deux formats ont suivi les protocoles standard, avec 4 ou 5 étalons de concentration et un blanc au Tris-EDTA dans chaque condition.
Pour l’ADN simple brin, trois ADN distincts ont été testés : Myt1 Reverse et Myt1 Forward qui sont des primers d’environ 45 paires de bases (pb), ainsi que 3XNLS-BFP-R, une séquence d’ADN codant une protéine fluorescente bleue d’environ 800 à 1 100 pb. Les concentrations testées vont de 2.3 ng/mL à 2 μg/mL. Les courbes standard et les graphiques présentés ici correspondent au Myt1 Forward, donné à titre d’exemple représentatif. Pour l’ADN plasmidique, les concentrations testées vont de 0.5 ng/mL à 0.3 μg/mL.
Chaque condition a été mesurée en trois réplicats. Les courbes standards, les moyennes des 3 réplicats et les coefficients de variation (CV<14%) ont été comparés entre consommables neufs et reconditionnés afin d’évaluer tout effet sur la précision et la variabilité des mesures.
Figure 1. Quantification de l’ADN sur des tubes neufs et des tubes reconditionnés. Aucune différence significative n’a été observée. Chaque concentration a été testée en 3 réplicats par condition.
Résultats
Les tubes reconditionnés ont permis d’obtenir des courbes standard comparables à celles obtenues avec des consommables neufs, et ce pour les deux types d’ADN (panneaux A et B). Aucune différence marquée n’a été détectée au niveau du signal pour aucun des étalons, avec des écarts entre conditions très faibles (panneaux C et D). La marque Low-binding (M1) n’a montré aucun avantage détectable aux concentrations étudiées.
Les écarts et les coefficients de variation ont légèrement varié d’une concentration à l’autre et d’un réplicat à l’autre, mais sans tendance constante en faveur de l’un ou l’autre groupe, ce qui suggère que la variation observée reflète des facteurs expérimentaux normaux comme la préparation des dilutions, le pipetage ou le moment de la mesure, plutôt qu’un effet du reconditionnement.
Aux concentrations les plus basses, la variabilité est dominée par le bruit instrumental à l’approche de la limite de détection des kits, et non par un phénomène d’adsorption dépendant de la concentration.
Ces résultats confirment que les tubes de microcentrifugation reconditionnés peuvent être réutilisés pour la quantification de l’ADN, aussi bien plasmidique que simple brin, sans perte de précision ni de fiabilité même pour de très faibles concentrations.